Блог

Jun 23, 2023

Внутрикожно доставляемая мРНК

Природная биомедицинская инженерия

Природная биомедицинская инженерия (2023 г.) Процитировать эту статью

29 тысяч доступов

4 цитаты

281 Альтметрика

Подробности о метриках

Успех терапии матричной РНК во многом зависит от доступности систем доставки, которые обеспечивают безопасную, эффективную и стабильную трансляцию генетического материала в функциональные белки. Здесь мы показываем, что внеклеточные везикулы (ВВ), полученные посредством клеточной нанопорации из дермальных фибробластов человека и инкапсулирующие мРНК, кодирующую коллаген внеклеточного матрикса α1 типа I (COL1A1), индуцируют образование коллагеново-белковых трансплантатов и уменьшают образование морщин в коллагеновых клетках. истощенная кожная ткань мышей с фотостареющей кожей. Мы также показываем, что внутрикожная доставка ЭВ, нагруженных мРНК, с помощью набора микроигл приводила к продолжительному и более равномерному синтезу и замене коллагена в дерме животных. Внутрикожная доставка мРНК COL1A1 на основе EV может стать эффективной белково-заместительной терапией для лечения фотостареющей кожи.

Недавние разработки в методах модификации информационной РНК повысили терапевтическую эффективность доставки мРНК и ее потенциал для краткосрочного клинического применения, включая белок-заместительную терапию и вакцинацию против вируса тяжелого острого респираторного синдрома, вызванного коронавирусом 2 (SARS-CoV-2)1, 2. Однако внутренняя неспособность и потенциальная иммуногенность мРНК требуют, чтобы они были инкапсулированы в средства доставки. Современные способы доставки мРНК основаны на использовании носителей липидных наночастиц (ЛНЧ) для инкапсуляции и транспорта3,4. Однако ЛНЧ создают несколько серьезных проблем, включая цитотоксичность, плохое биораспределение, отсутствие целевой специфичности и иммуногенности. Эти проблемы могут быть вызваны необходимостью поверхностного ПЭГилирования (ПЭГ означает поли(этиленгликоль)) ЛНЧ для улучшения периода их полувыведения из циркуляции и снижения неспецифического клиренса5,6. Примечательно, что введение ЛНЧ людям было связано с анафилаксией, гиперчувствительностью и аутоиммунными побочными эффектами7,8. Таким образом, идентификация носителей мРНК, которые могут преодолеть некоторые из этих проблем, связанных с ЛНП, будет полезна для дальнейшей разработки терапии на основе мРНК.

Внеклеточные везикулы (ВВ), включая экзосомы и микровезикулы, играют важную роль в транспорте биомолекул и нуклеиновых кислот, включая мРНК, в организме человека9,10,11. В результате в последние годы ЭВ стали перспективными носителями для терапии на основе нуклеиновых кислот благодаря их внутренней биосовместимости, способности преодолевать физиологические барьеры и низкой иммуногенности12,13. В отличие от ЛНЧ, ЭВ, включая экзосомы, эндогенно продуцируются клетками организма и приводят к снижению уровня воспалительных реакций. Более того, были разработаны стратегии дешевого и простого производства больших количеств экзосом. Ранее мы сообщали о методе клеточной нанопорации (CNP), при котором временные нанометрические поры создавались на поверхности исходных клеток, чтобы обеспечить крупномасштабную загрузку мРНК с полным транскриптом в секретируемые EV14. Здесь, используя мышиную модель острого фотостарения, которая точно имитирует патофизиологические особенности поврежденной старением кожи у людей15, мы показываем полезность терапии мРНК COL1A1 на основе экзосом для замены потери дермального коллагенового белка в качестве омолаживающего лечения фотостарения. кожа. Чтобы повысить эффективность доставки и удержания мРНК, мы также показываем, что доставка мРНК коллагена с помощью микроигольного пластыря с гиалуроновой кислотой (HA) (COL1A1-EV MN) позволяет более эффективно распределять мРНК в дерме, что приводит к образованию прочного коллагена. -приживление белков и улучшение лечения морщин на фотостареющей коже.

Атрофия дермы вследствие необратимой потери коллагена является признаком старения кожи16,17. Многочисленные методы были направлены на восстановление потери белка коллагена в коже: от безрецептурных и фармацевтических подходов (антиоксиданты18,19,20, ретиноиды21, пептиды22,23) до медицинских устройств (то есть лазерной терапии24 и синтетических дермальных наполнителей25,26). . Однако ни одна из этих существующих технологий не смогла обеспечить долгосрочную замену эндогенного коллагена для поддержания прочности, упругости и эластичности кожи с течением времени27,28,29. Стимулирование фибробластов, ответственных за синтез белков коллагена, также может быть эффективным способом краткосрочного контроля старения кожи30. Однако по мере старения фибробласты постепенно теряют способность пролиферировать и синтезировать коллаген, что создает проблемы для долгосрочных методов замены коллагена для лечения старения31. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы стремились заменить белок коллагена в модели фотостарения истощения коллагена с помощью доставки мРНК, опосредованной EV. Чтобы создать ЭВ, нагруженные мРНК человеческого коллагена I альфа I (COL1A1), мы применили метод CNP, который включал высеивание монослоя неонатальных фибробластов дермы человека (nHDF) на поверхность нанопор и нанотрансфекцию клеток плазмидой COL1A1-GFP ( Рис. 1а и дополнительный рисунок 1а)14. ЭВ выделяли из культуральной среды на следующий день после трансфекции. Было обнаружено, что клетки, обработанные CNP, имеют в 10 раз большее количество EV на клетку по сравнению с клетками, обработанными стандартной объемной электропорацией (BEP), которую проводили с использованием параллельных электродов в виде кювет, как описано ранее32, или необработанных nHDF в культуре (рис. 1б). Электромобили, полученные каждым методом, характеризовались распределением по размерам с пиком около 150 нм в диаметре, что было определено с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA), и 80% интенсивности в пике режима с помощью динамического рассеяния света (DLS) (рис. 1c и дополнительные данные). Рис. 1б,в) с индексом полидисперсности (PDI) 0,12–0,25. Эксперименты по вестерн-блоттингу показали, что экспрессия биомаркеров экзосом (CD9, CD63, TSG101) и микровезикул (ARF6) в группе, получавшей CNP, была значительно выше, чем в группе, не получавшей лечения, что подтверждает увеличение секретируемых EV (дополнительный рисунок 1d). Кинетический анализ также показал, что высвобождение ЭВ, оптимизированное по напряжению, достигало пика через 8 часов после индукции CNP, при этом продолжающаяся секреция отмечалась в течение следующих 24 часов (дополнительные рисунки 1e,f). Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-qPCR) показала, что EV, секретируемые CNP, содержат более чем в 200 раз больше мРНК COL1A1, чем EV, секретируемые BEP, и в 3000 раз больше мРНК COL1A1, чем EV, секретируемые из нетрансфицированных клеток (рис. 1d). ). Оценка гель-агарозы с помощью биоанализатора продемонстрировала полноразмерную транскрибируемую мРНК COL1A1 длиной около 4000 нуклеотидов (рис. 1e). ЭВ, полученные с помощью CNP, демонстрировали структурную стабильность при хранении для доклинического введения при 4 ° C без изменений внешнего вида, свойств мембраны и размера при оценке с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ), атомно-силовой микроскопии (АСМ) и NTA (дополнительный рисунок). 2а–в). Кроме того, мРНК COL1A1, инкапсулированная в ЭВ, была стабильной как при комнатной температуре, так и при 4 ° C, а также демонстрировала стабильность в сыворотке, тем самым подчеркивая их потенциал для будущего клинического применения (дополнительный рисунок 2d,e).